熱搜關(guān)鍵詞: 二氧化氯溶液 消毒凈化劑 過一硫酸氫鉀復(fù)合鹽 二氧化氯 亞硝酸還原酶
摘 要:為了保持養(yǎng)殖大黃魚肌肉質(zhì)量,延長貨架期,本試驗采用冷藏保鮮、冰藏保鮮、 ClO?保鮮等三種保鮮方式對鮮黃魚進行處理。以大黃魚肌肉的微生物變化和品質(zhì)特性作為評價指標,并通過宏基因組高通量測序技術(shù)分析了經(jīng)上述三種方法處理后大黃魚肌肉優(yōu)勢菌屬的變化。
結(jié)果表明:冷藏保鮮和冰藏保鮮的菌落總數(shù)和TVB-N值隨著貯存天數(shù)的增加而增大,而 ClO?保鮮相對于其他處理方式變化幅度最?。蝗N處理組的硬度、彈性和咀嚼性均先上升后下降,而 pH 呈先下降再上升的變化,以 ClO?保鮮組的變化幅度最?。?ClO?保鮮組在貯藏前期脂肪的氧化程度高于其他兩組,貯藏5 d 后差異顯著 (p<0.05);通過電子鼻對大黃魚肌肉風味分析表明 ClO? 保鮮組對其風味保持效果較好;高通量測序結(jié)果顯示,三個處理組的優(yōu)勢菌屬均為希瓦氏菌屬、假單胞菌屬,但菌群結(jié)構(gòu)有所差別,ClO?可以減少大黃魚肌肉菌屬的種類。
大黃魚(Pseudosciaena crocea)是我國重要的經(jīng)濟水產(chǎn)養(yǎng)殖魚之一, 因其味道鮮美, 富含營養(yǎng)成分,而深受大眾歡迎。由于新鮮大黃魚含有較高的蛋白質(zhì)和水分,極易腐敗變質(zhì)。目前關(guān)于大黃魚的保鮮方法主要有輻照保鮮、超高壓保鮮、氣調(diào)保鮮、復(fù)合保鮮等,但因為面臨技術(shù)不成熟及商業(yè)成本高等問題還不能完全普及。冰藏保鮮是常見的保鮮方法,但大黃魚的肌肉易被腐敗微生物侵染而腐敗變質(zhì)。二氧化氯(Chlorine Dioxide,ClO?)作為一種新型的保鮮介質(zhì),對水體中傳播的病原微生物、病毒、芽孢都有極強的殺滅作用,且具有安全無殘留,效率高、副產(chǎn)物少、成本低等優(yōu)點,是目前國際上公認的高效殺菌劑和食品保鮮劑,研究表明ClO?對微生物的細胞壁有較好的透過和吸附性能,控制微生物蛋白質(zhì)的合成,并使蛋白質(zhì)中的部分氨基酸發(fā)生氧化還原反應(yīng),使氨基酸分解破壞,最終導(dǎo)致微生物死亡。
目前,國內(nèi) ClO?在果蔬保鮮方面有較多研究,但研究 ClO?對大黃魚肌肉保鮮處理的報道甚少。本研究選取大黃魚肌肉作為原材料,以三種不同的保鮮方式對其進行處理,測定其微生物變化和品質(zhì)特性,并利用高通量測序技術(shù)分析大黃魚肌肉腐敗菌,旨在進一步提高大黃魚肌肉品質(zhì)和延長產(chǎn)品保藏期,為穩(wěn)定型 ClO?冰對大黃魚肌肉的保鮮產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
大黃魚:選取表皮光澤無損傷,魚鱗完整并有少量透明粘液,個體均勻,重量約為(450±50) g/條的鮮活大黃魚。ClO? 試劑(A 試劑、B試劑);基因組 DNA 抽提試劑盒;Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒 ; Taq DNA 聚合酶 ; MagicPure Size Selection DNA Beads 。A96FS70TI 型變頻冰箱; TX-XT plus 質(zhì)構(gòu)儀 ; PEN3 型電子鼻 ; Pico-21臺式離心機; 凝膠成像系統(tǒng) ; Q32866 Qubit? 2.0熒光計 Invitrogen; T100TM Thermal Cyeler PCR 儀BIO-RAD。
1.2 實驗方法
1.2.1 ClO?冰的制備
參照純歐德ClO?試劑說明書,配制濃度為300 mg/L 的高濃度的 ClO?溶液,將稀釋至5mg/L的溶液置于制冰機中, 制備大小約(0.75±0.25)cm3的穩(wěn)定型ClO?碎冰。
1.2.2 保鮮處理
活體大黃魚載氧運至實驗室后,放在冰水中30min冷卻致死后隨機分成三組,冷藏保鮮(CK組):大黃魚裝入帶孔泡沫箱后并置于0~4℃環(huán)境下;冰藏保鮮(IC組):大黃魚裝入帶孔泡沫箱后加入普通碎冰覆蓋,置于0~4℃環(huán)境下;ClO?保鮮(CD組):大黃魚裝入帶孔泡沫箱后加入 ClO?碎冰覆蓋,置于 0~4℃環(huán)境下,不同組碎冰覆蓋厚度均為(3.0±0.5)cm,每隔24h補充一次碎冰。選取大黃魚背部肌肉去鱗、去皮進行指標測定, 并在第0、 1、3、5、9、13、17、21d進行樣品測定分析。
1.2.3 高通量測序鑒定
1.2.3.1 樣品預(yù)處理
將不同處理組的大黃魚放入滅菌泡沫盒中0~4℃條件下保藏7d后各取肌肉200mg。將樣品放入2mL 離心管中,加入70%乙醇溶液1mL, 震蕩, 離心(10000r/min,3min),移去上層液體。加入1xPBS溶液,震蕩混勻并再次離心(10000r/min,3 min),之后移去上層液體。將2 mL 離心管倒置于吸水紙上1m in 至無液體流出為止。離心管于55 ℃烘箱直至殘留酒精完全揮發(fā)。
1.2.3.2 宏基因組DNA的提取
采用E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒提取總DNA, 并用凝膠電泳(濃度為1%瓊脂糖)對所提取總DNA 的完整性進行檢測,檢測濃度采用超微量分光光度計(Thermo NanoDrop 2000)。將檢測合格的總DNA 于-20℃條件下保存,用于后續(xù)實驗。
1.2.3.3 PCR 擴增及高通量測序
經(jīng) PCR 擴增, 使用Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒進行基因組 DNA 精確定量。用于PCR 擴增的引物與 Miseq 測序平臺的 V3-V4 通用引物已經(jīng)融合, 341F 引物:CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG; 805R 引物:GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA GACTACHVGGGTATCTAATCC。 經(jīng)兩輪PCR 擴增完成接頭序列的連接。PCR 結(jié)束后,先利用瓊脂糖進行電泳鑒定,之后再進行DNA 純化回收。使用Qubit 2.0 DNA測定試劑盒精確定量回收的DNA,以便以1:1 的等量混勻后進行測序。每個樣品等量混合后的DNA 量取 10 ng,最終上機時測序濃度為20 pmol。
1.2.4 菌落總數(shù)
依據(jù)GB 4789.2-2016 菌落總數(shù)的測定。
1.2.5 pH
依據(jù)GB 5009.237-2016 食品中pH的測定。
1.2.6 質(zhì)構(gòu)特性測定
參考廖媛媛等的操作方法略作修改,將三組大黃魚室溫下解凍20min切取背部肌肉2.5cm×2.5cm×1.5cm| 的無刺樣品,用TX-XT plus質(zhì)構(gòu)儀進行測定。探頭選用直徑為5cm 的圓柱形探頭。壓縮探針速度為1mm/s,測試壓縮比為50%,平行測定6次。
1.2.7 揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)
按照GB 5009.228-2016方法進行試驗。
1.2.8 TBARS的測定
參考馬麗珍等的操作方法略作修改,稱取10.0 g背部肌肉研細后,置于100 mL 的加蓋錐形瓶中, 加入50mL7.5%的三氯乙酸(含0.1%EDTA), 混勻后, 室溫放置30 min,浸漬液用雙層濾紙過濾。濾液重復(fù)用雙層濾紙過濾一次。取5mL 濾液加入25 mL 離心管中, 加入5mL 0.02 mol/L硫代巴比妥酸溶液, 在90℃水浴40 min。之后流水冷卻。再加入 5 mL 氯仿并搖勻。分層后取上清液分別在532 nm和600 nm處比色。記錄吸光度值并用以下公式計算TBARS值。TBARS 值 與TBARS反應(yīng)的物質(zhì)的量(TBARS) 單位表示為mg·MA/kg。
1.2.9 電子鼻檢測
參考楊茗媛等的操作方法略作修改,將不同處理組的大黃魚肌肉解剖,取背部同一部位肌肉0.50g于10mL頂空瓶中,加蓋密封,放入4℃樣品盤待檢,樣品平衡時間20 min,平衡溫度35℃, 取樣體積3mL; 進樣速度25mL/s, 進樣口溫度45℃。
1.3 數(shù)據(jù)處理
使用SAS 8.5 及 Origin 9.0進行數(shù)據(jù)分析處理,數(shù)據(jù)結(jié)果均以“mean±SD”來表示, 每組實驗重復(fù)5次。同一列中的不同小寫字母表示顯著差異(p<0.05)。
2 結(jié)果與分析
2.1 不同處理方式對大黃魚肌肉貯藏期間細菌群落結(jié)構(gòu)的影響由表 1 可以看出,CK 組中的腐敗菌是希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、冷桿菌屬、摩根氏菌屬、氣單胞菌屬。在IC組中,希瓦氏菌屬、假單胞菌屬、冷桿菌屬是優(yōu)勢菌,而在CD 組中,僅有希瓦氏菌屬和假單胞菌屬是優(yōu)勢細菌。Ge 等研究腐敗大黃魚肌肉中分離出10株菌,其中8株產(chǎn)生H?S的菌株與希瓦氏菌屬密切相關(guān),另外的兩株分離株分別被鑒定為熒光假單胞菌和 Pfragi。加冰處理對摩根氏菌屬、弧菌屬與類香味菌屬有明顯的抑制效果,可能由于加冰處理抑制了嗜熱微生物的生長。但ClO?處理后大黃魚肌肉中的菌屬種類均顯著降低,由于 ClO?分子外層具有一對未成對的活潑的自由電子,具有很強的氧化能力,破壞微生物的結(jié)構(gòu),從而改變微生物菌群結(jié)構(gòu)及造成數(shù)量降低。
2.2 不同處理方式對大黃魚肌肉菌落總數(shù)的影響
圖1表明,隨著貯藏時間的延長,各組菌落總數(shù)均呈上升趨勢。IC組前期上升趨勢較CK 組不顯著(p>0.05),后期上升趨勢有顯著差異(p<0.05)。從貯藏效果來看, CD 組>IC 組>CK 組,說明 ClO?冰殺菌及抑制細菌增長繁殖的效果優(yōu)于普通冰。ClO?分子外層具有一對未成對的活潑的自由電子,具有很強的氧化能力,可以使微生物中含有的蛋白質(zhì)(酶)中氨基酸間的鏈氧化斷裂,使蛋白質(zhì)失去活性,阻止細胞再生。季曉彤等研究也證 明了 可以起到殺菌并延長貨架期的作用。
2.3 不同處理方式對大黃魚肌肉pH的影響
圖2結(jié)果所示,在貯藏過程中,每組的pH呈先下降后上升趨勢。其中,CD組與前兩組比較有顯著性差異(p<0.05)。貯藏初期,魚體經(jīng)歷僵硬、自溶兩個過程中,僵硬期微生物使糖原和 ATP 分解產(chǎn)生乳酸、磷酸使肌肉組織酸性增強,導(dǎo)致 pH 下降,自溶期 pH 開始升高,由于肌肉中大量蛋白質(zhì)分解為氨基酸和可溶性含氮物,這為微生物的繁殖提供了條件。pH 下降后又開始緩慢上升是由于肌肉內(nèi)源性及微生物來源蛋白酶降解氨基酸產(chǎn)生胺類等堿性物質(zhì)所致。CD組的pH下降緩慢,ClO?具可以抑制蛋白質(zhì)(酶)中的氨基酸鏈發(fā)生斷裂,從而使蛋白質(zhì)失去活性,最終使糖原和ATP
分解產(chǎn)酸量減少。同時,ClO?處理后下降緩慢是由于微生物中的外源性蛋白酶失去活性,進一步抑制體系中產(chǎn)胺微生物的滋生,從而降低自溶程度,使pH 上升緩慢。
2.4 不同處理方式對大黃魚肌肉質(zhì)構(gòu)特性的影響
圖3結(jié)果表明,隨著貯藏時間的延長,CD組相比較CK組和IC組的硬度(A圖)、彈性(B圖)、咀嚼性(C圖)均呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢,在貯藏3天后CD組下降速度較CK組和IC 組緩慢,出現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。由于養(yǎng)殖大黃魚在死后,進入了僵硬期,肌肉的質(zhì)地特性受蛋白質(zhì)、水分、脂肪含量的影響,貯藏期間,肌肉的水分含量逐漸減少,脂肪和蛋白質(zhì)逐漸被氧化和分解:隨后由于內(nèi)源蛋白酶和腐敗微生物的降解導(dǎo)致蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,繼而導(dǎo)致硬度、彈性、咀嚼性等等指標下降。結(jié)果中 CD 組樣品的質(zhì)構(gòu)特性優(yōu)于 CK組樣品,這是由于樣品經(jīng)過ClO?處理后對微生物的抑制作用較強,微生物無法通過生物活性與代謝活動對大黃魚肌肉的蛋白質(zhì)產(chǎn)生影響; 同時,冰藏的處理方式使樣品迅速降溫,抑制其組織內(nèi)部酶的活性及細胞的代謝,從而起到保持蛋白質(zhì)特性的目的。
2.5 不同處理方式對大黃魚肌肉TVB-N的影響
從圖4 中可知,隨著貯藏時間的延長,不同處理組的 TVB-N 值均呈上升趨勢且差異顯著(p<0.05)。在貯藏期間, IC組和CD組樣品的TVB-N值上升趨勢低于CK組。研究表明普通冰和ClO?可以抑制微生物的生長繁殖并降低內(nèi)源酶的作用,從而延緩蛋白質(zhì)的分解,降低魚肉的腐敗程度。CD 組相比于IC 組能夠較好地抑制 TVB-N值的上升,由于ClO?通過使微生物蛋白質(zhì)失活達到殺菌目的,有利于降低 TVB-N的生成速率,表明 ClO?可以有效抑制微生物的生長。
2.6 不同處理方式對大黃魚肌肉TBARS值的影響
TBARS 是評估脂質(zhì)氧化程度的重要參考指標,TBARS值與反應(yīng)中產(chǎn)生的醛、酮等小分子物質(zhì)成正比,說明TBARS 值越大,其脂質(zhì)氧化程度越高。圖 5 表明不同處理組對養(yǎng)殖大黃魚肌肉的 TBARS 值的影響,貯藏初期新鮮大黃魚肌肉的 TBARS 值為 0.26mg/100g左右。貯藏前期, CD 組的TBARS 值均呈現(xiàn)上升趨勢且較CK 組和 IC 組差異極顯著(p<0.0001), 說明氧化程度嚴重; 其中,
貯藏初期IC組大黃魚肌肉的 TBARS 值上升速率低于 CK 組。貯藏前期 ClO?處理組上升較快,可能由于 ClO?具有強氧化性,使脂肪氧化成丙二醛(MDA),隨后ClO?進一步將醛類物質(zhì)氧化為羧酸,使TBARS 含量下降。楊賢慶等研究不同濃度的 ClO?對羅非魚魚丸的 TBARS 值有較好的抑制效果,且低濃度的ClO?就能有較好的抑制效果,與本研究結(jié)果一致。
2.7 不同處理方式對大黃魚肌肉氣味變化的影響
電子鼻可以靈敏地檢測到不同大黃魚肌肉氣味的變化,利用電子鼻作為完善食品在保藏期間氣味變化的衡量標準,可以更準確直觀的反應(yīng)大黃魚肌肉品質(zhì)變化及腐敗程度,避免主觀因素對感官評價的影響。圖6通過執(zhí)行載荷分析來消除冗余傳感器,根據(jù)分析,傳感器S2(氮氧化物)、S6(甲烷)、S7(無機硫化物)和S9(芳香成分,有機硫化物)對大黃魚背部肌肉具有較高的響應(yīng)值,與前人研究結(jié)果相似。腐敗希瓦氏菌是一種典型的冷藏海魚腐敗菌,具有較強的腐敗活性,可產(chǎn)生H?S,還原TMAO等物質(zhì);假單胞菌可以產(chǎn)生大量的醛、酮和酯類等物質(zhì)。圖7 表示不同處理條件下養(yǎng)殖大黃魚背部肌肉電子鼻PCA分析結(jié)果,每個橢圓代表不同處理組,橢圓分布距離越遠,說明氣味差異性越大。圖7的PC1、PC2的方差貢獻率分別為92.47%、5.17%,PC1、PC2的總貢獻率為97.64%。CK組、IC組、CD組分別在貯藏5d、9d、17d后的橢圓距離新鮮樣品(0d) 較遠, 這與菌落總數(shù)和TVB-N值一致,表明肌肉接近腐敗的終點。由于PC2的方差貢獻率為5.17%,說明ClO?對于大黃魚肌肉貢獻率影響不大,說明其貢獻率主要源于微生物腐敗以及蛋白質(zhì)自溶。
3 結(jié)論
通過高通量測序分析表明 ClO?處理能降低菌落總數(shù),改變菌相組成。大黃魚肌肉經(jīng)過ClO?冰處理后,其TVB-N值、TBARS值、硬度、咀嚼性和pH等理化指標相較于冰藏保鮮變化較為小,表明ClO?冰可以使大黃魚肌肉保持較好的理化品質(zhì),并延長其貨架期。同時,從氣味變化可以看出,肌肉經(jīng)ClO?冰處理后,不僅減少其品質(zhì)劣變而且又不影響大黃魚肌肉本身的風味。